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DETERMINATION DE LA CHLOROPHYLLE

PAR FLUORIMETRIE

Version : 1.11

Protocole SOMLIT CHLOROPHYLLE 1.11

Date de création : 20 novembre 2007

Date de dernière modification : 2 Décembre 2008

Rédigé par : Isabelle Billy, Louise Oriol, Laure Mousseau, Ornella Passafiume

Visé par : Responsable qualité local : Laure Mousseau - Responsable qualité national : Nicolas Savoye

I - Introduction

La mesure de la chlorophylle a est un indicateur de la biomasse phytoplanctonique du milieu marin.

Ce pigment est présent chez tous les organismes photosynthétiques aérobies ; il est sensible à la lumière et peut être dégradé en présence d'acide.

La méthode fluorimétrique préconisée a été élaborée par Yentsh et Menzel (1963), puis Holm-Hansen et al (1965), et Strickland et Parsons (1972). Elle utilise la propriété qu'ont les pigments chlorophylliens d'émettre une fluorescence rouge lorsqu'ils sont excités par de la lumière bleue ou ultra-violette. Le fluorimètre doit donc être équipé d'un filtre d'excitation bleu (446-500nm) et d'un filtre d'émission rouge ( > 665nm).

Les concentrations en chlorophylle a sont exprimées en µg/l, et la précision analytique requise est de +/- 10%.

II - Précautions particulières

La chlorophylle a est peu sensible à la pollution mais très sensible à la dégradation. Toutes les étapes doivent être réalisées le plus possible à l'abri de la lumière et de la chaleur.

La préparation des réactifs, mais également la préparation des échantillons, ainsi que la mesure au fluorimètre doivent se faire sous hotte aspirante afin éviter au manipulateur le contact avec les vapeurs toxiques d'acétone ; le préparateur doit porter gants et blouse.

Il ne doit pas y avoir de manipulation d'acide sous cette hotte pour éviter toute contamination et toute dégradation des pigments par des traces d'acide.

III - Matériel et appareillage utilisés

Bouteille de prélèvement Niskin

Flacons de prélèvement opaques

Filtres GF/F de diamètre 25 mm ou 47 mm (adapté à la station)

Pinces à bouts plats

Tubes de stockage

Tubes d'extraction à bouchage hermétique

Baguette de verre à brisure nette

Centrifugeuse 3000 tr/min réfrigérée

Tubes de lecture

Fluorimètre Turner Design 10-AU (recommandé)

Spectrophotomètre

Standard solide de chlorophylle (10-AU-904 ou 7000-904 chez Turner Designs par exemple)

IV - Produits chimiques utilisés

Acétone pure 99% qualité pour analyse

HCl 37% qualité pour analyse

Chlorophylle a (Sigma-Aldrich : Anacystis nidulans  : ref C-6144 ou Chlorophyll a from Spinach  : ref C-5753)

V - Préparation du matériel

Avant la sortie en mer, s'assurer de la présence à bord du bateau des flacons opaques propres et étiquetés ainsi que d'une glacière contenant des pains de glace pour le transport des échantillons.

VI - Prélèvement, conditionnement et conservation des échantillons

Les prélèvements d'eau de mer sont réalisés à l'aide de bouteilles Niskin.

L'eau est récupérée dans des flacons opaques rincés 3 fois avec l'échantillon, en utilisant des tuyaux souples. Les échantillons d'eau de mer sont conservés au frais et à l'abri de la lumière (e.g. dans une glacière munie de pains de glace).

La filtration par aspiration sous vide doit être réalisée le plus rapidement possible après le prélèvement (pas plus de 2 heures).

La rampe de filtration est reliée à une pompe à vide munie d'un manomètre. Le vide ne doit pas dépasser 0,2 bar de dépression (ou 150 mm de Hg ou 6 Inch).

Utiliser des filtres Whatman GF/F (0,7µm de 'porosité') de 25mm ou 47mm de diamètre

Placer le filtre sur la base de filtration à l'aide d'une pince à bouts plats.

Placer l'entonnoir de filtration.

Homogénéiser le flacon de prélèvement par quelques retournements. Procéder à une agitation douce car une agitation vigoureuse risque d'éclater les cellules planctoniques.

Filtrer 1L (volume mesuré à l'éprouvette), en fonction des caractéristiques du milieu.

Couvrir les entonnoirs et l'éprouvette (par ex de papier aluminium) pendant la filtration.

Juste avant que le filtre ne vienne à sec, arrêter le vide (pour éviter l'éclatement des cellules).

Plier le filtre à l'aide des pinces, face chargée à l'intérieur. Eviter tout contact des pinces et des particules présentes sur le filtre.

VII - Conservation et stockage

Placer le filtre dans un tube d'extraction ou dans un tube de stockage identifié au numéro de l'échantillon.

Réaliser immédiatement l'extraction à l'acétone dans le tube d'extraction ou placer immédiatement le tube de stockage à -20°C (délai de conservation : 1 semaine) dans le congélateur situé à la vieille forge (à côté de la paillasse filtration).

Si l'échantillon doit être déplacé, veiller à ce qu'il le soit toujours à température négative.

VIII - Préparation des réactifs :

Préparation de l'acétone à 90%

Introduire 50ml d'eau déionisée dans une fiole jaugée de 500ml ; compléter à 500ml avec l'acétone pur.

Attention : ne pas se placer sous la hotte à acide pour effectuer cette dilution !

Préparation de HCl 0,3N

Diluer 40 fois l'HCl 37% (12N) dans de l'eau déminéralisée : 2,5ml d'HCl pour 100ml de solution . Attention : verser d'abord une partie de l'eau (~la moitié) ; ajouter l'acide puis compléter à 100ml avec l'eau déminéralisée.

IX - Préparation des échantillons :

Cette étape doit être réalisée le plus possible à l'abri de la lumière et de la chaleur. Cette phase doit également se faire sous une hotte, pour éviter les vapeurs toxiques d'acétone. Il ne doit pas y avoir de manipulation d'acide sous cette hotte pour éviter toute contamination et toute dégradation des pigments par des traces d'acide.

Extraction

Placer, à l'aide de la pince à bouts plats, les filtres encore congelés dans les tubes à centrifuger en verre. Penser à la numérotation.

Ajouter 3ml d'acétone 90% à l'aide d'une dispensette. Broyer le filtre à l'aide d'une baguette de verre à brisure nette. Compléter le volume d'extraction (6 ml) avec 3ml d'acétone 90%.

Placer les tubes une nuit au réfrigérateur (+4°C), sur un portoir recouvert de papier aluminium, afin de protéger les échantillons de tout choc lumineux.

Précautions particulières

Ne pas sortir du congélateur trop de filtres à la fois, et surtout ne pas les laisser décongeler sur la paillasse. Il est préférable de les conserver dans le congélateur ou à défaut dans la glace pilée le plus longtemps possible avant de les placer dans l'acétone.

X - Préparation de l'appareil et étalonnage :

Allumer le fluorimètre 30mn avant de procéder aux mesures.

Mesure du blanc

Le blanc constitué d'acétone à 90% est mesuré avant chaque mesure d'échantillon. Il permet de régler le zéro de l'appareil.

Etalonnage du Fluorimètre :

L'étalonnage de l'appareil doit être réalisé régulièrement (2 fois par an et au retour d'un déplacement, mission par exemple, ou après tout changement d'un élément de l'appareil).

Cette phase doit être réalisée le plus possible à l'abri de la lumière et de la chaleur.

Solution-mère de chlorophylle a :

Diluer le contenu de l'ampoule de chlorophylle a ( Anacystis nidulans  : 1mg ; ref C-6144 ou chlorophyll a from Spinach : 1mg ; ref C-5753 chez Sigma-Aldrich) dans 100ml d'acétone à 90%.

Solution I  : diluer 20 fois cette solution : 5ml dans 100ml d'acétone à 90%. Régler le zéro de l'appareil avec l'acétone à 90%, et mesurer la densité optique (Do) de la solution I au spectrophotomètre à 664 nm afin d'en déduire sa concentration réelle (équation de Beer-Lambert) :

Do = £ . L . C £ : coefficient d'absorption spécifique = 87 , 67

L : longueur du trajet optique en cm

C : concentration en g/l

Il faut que la Do soit inférieure à 0 , 02 pour que la relation entre la concentration et la fluorescence soit toujours linéaire.

Préparer ensuite la gamme étalon suivante :

N° Tube

Solution I chl a (ml)

Acétone à 90%(ml)

1

6

0

2

5

1

3

4

2

4

3

3

5

2

4

6

1

5

7

0.6

5.4

8

0.3

8.7 (solution II)

Solution II

9

2

4

10

1

5

Mesurer pour chaque tube la fluorescence Fo avant acidification et Fa après acidification (ajout de 50µl d'HCl 0,3 N). 

Tracer la droite : Fo = Kc.Ca

Avec, sur l'axe des X les concentrations en chlorophylle a des différentes solutions Ca et sur l'axe des Y les fluorescences correspondantes Fo.

En déduire la constante de calibration Kx = 1/Kc.

Faire le rapport Fo/Fa pour chaque dilution. Faire la moyenne de ces rapports : (Fo/Fa) max.

Noter ces valeurs sur la fiche de suivi «  calibration » dans le dossier métrologie.

Contrôle Qualité

La justesse des mesures doit être contrôlée à l'aide du standard solide de chlorophylle (Turner Designs 10-AU-904, Turner Designs Trilogy).

Ce standard doit être mesuré le jour de l'étalonnage puis chaque fois que l'on mesure un lot d'échantillons. Ce standard ne nécessite pas de condition spéciale de stockage. Il n'est sensible ni à la lumière ni à la température. Il est stable pendant des années.

Ces mesures permettent de valider l'adéquation avec la courbe d'étalonnage.

Noter les valeurs du standard solide sur la fiche de suivi «  matériaux de référence » dans le dossier métrologie.

XI - Mesure

Sortir les tubes du réfrigérateur.

Agiter les tubes.

Centrifuger 5 min à 3000 tours/min de préférence dans une centrifugeuse réfrigérée à +4°C. Remettre en suspension les morceaux de filtre qui se sont déposés sur les parois du tube.

Centrifuger à nouveau 10 min.

Prélever alors le surnageant et le transférer dans un tube de mesure. Mesurer la fluorescence Fo.

Rajouter 50 µl d'HCl 0,3N et mesurer la fluorescence Fa.

Contrôle Qualité

La justesse des mesures doit être contrôlée à l'aide du standard solide de chlorophylle (Turner Designs 10-AU-904 ou Turner Designs 7000-904). Ce standard doit être mesuré le jour de l'étalonnage puis chaque fois que l'on mesure un lot d'échantillons.

XII- Calcul de la concentration en chlorophylle a des échantillons :

Selon Holm-Hansen (1965) et Lorenzen (1967)

[Chla]= Kx . [(Fo/Fa) max ] . [ ( Fo - Fa ) / ( (Fo/Fa) max - 1 ) ] . [ v ext / v filtré ]

Légende :

[Chla] concentration en chlorophylle active a, [µg/L]

Fo fluorescence de l'échantillon avant acidification

Fa fluorescence de l'échantillon après acidification

v ext volume de l'extrait acétonique, [L]

v filtré volume de l'eau de mer filtré, [L]

(Fo/Fa) max rapport d'acidification de l'appareil de mesure (cf. étalonnage du fluorimètre).

Kx constante de calibration du fluorimètre

XIII - Entretien du matériel :

Rincer la rampe de filtration ainsi que les systèmes de filtration, l'éprouvette et les flacons de prélèvement à l'eau douce. Effectuer un dernier rinçage à l'eau déionisée.

Les tubes et matériel en verre sont nettoyés à l'eau déionisée et séchés a l'étuve (tubes renversés sur les portoirs).

Les éprouvettes, flacons et tubes sont stockés à l'abri de la poussière.

XIV - Conservation et entretien de l'appareillage

Eteindre l'appareil après utilisation prolonge la durée de vie de la lampe.

Eviter les éclaboussures d'échantillon, d'acétone ou d'acide dans le porte échantillon. Si cela se produisait, nettoyer délicatement à l'aide d'un papier non pelucheux.

XV - Evacuation des essais et déchets

L'acétone usagée est conditionnée dans des containers de recyclage prévus à cet effet.

XVI - Bibliographie :

Aminot A., Kérouel R., (2004). Hydrologie des écosystèmes marins. Paramètres et analyses. Ed. Ifremer, Méthodes d'anayse en milieu marin, 336 p.

Holm-Hansen O., C.J. Lorenzen, R.W. Holmes and J.D.H. Strickland (1965). Fluoremetric determination of chlorophyll. J. Cons. Perm. Int. Explor. Mer., 30(1) : 3-15

Lorenzen, C.J. (1967). Determination of chlorophyll and pheopigments : Spectrophotometric equations. Limnol. Oceanogr. 12 : 343-346

Strickland, J.D. and T.R. Parsons (1997). A practical handbook of seawater analysis, 2 nd ed. Bull. Fish. Res. Bd. Can. 167

Yentsch, C.S. and D.W. Menzel (1963) A method for the determination of phytoplancton chlorophyll and phaeophytin by fluorescence. Deep-Sea Res., 10 : 221-231